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    非基因組DNA的提取

    發(fā)布時間: 2021-10-22  點(diǎn)擊次數(shù): 1473次

    一、DNA提取方法簡介

    1基因組DNA的提取

    1.1、CTAB法

    1.2、SDS

    1.3、其它

    2非基因組DNA的提取

    2.1質(zhì)粒DNA的提取

    2.1.1、堿裂解法

    2.1.2煮沸法

    2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取

    差速離心結(jié)合SDS裂解法

    2、非基因組DNA的提取

    2.1、質(zhì)粒DNA的提取

    2.1.1堿裂解法

    堿裂解法原理

    染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子;

    當(dāng)用堿處理DNA溶液時,線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象;

    變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。

    堿裂解法流程圖

     

    圖片


    SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液1的成分及作用

    溶液Ⅰ  50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HClpH=8.0 葡萄糖增稠,使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部;EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase,不受EDTA影響,并且可以在后續(xù)步驟中被除去

    溶液Ⅱ   0.2M NaOH / 1% SDS 破細(xì)胞的主要是堿,而不是SDS,所以才叫堿法抽提

    溶液III   3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸

    這一步的K置換了SDS(十二烷基磺酸鈉)中的Na,得到PDS(十二烷基磺酸鉀)沉淀;SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了,同時基因組DNA也被PDS共沉淀 

    2.1.2、煮沸法

    煮沸法原理

    染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子;

    當(dāng)加熱處理DNA溶液時,線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象;

    變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。


    2.2線粒體、葉綠體DNA的提取

    線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器,自身可編碼蛋白,它們的比重和大小一定,因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定,根據(jù)這一原理,常用不同轉(zhuǎn)速的離心法,將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。

    差速離心法原理

    是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。

    將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)(蔗糖)中,以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心,比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降,比重小的卻處于上層,從而得以分離。


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